Geçen yıl, floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) ile ilgili ilk makalelerin yayınlanmasından bu yana 50 yılını kutladık. Sokaklardaki kitlelerle vahşi bir kutlama değildi, ne de üniversitelerde yaygın olarak kutlanmadı, aksine moleküler ölçekte birçok süreci anlamamızı ileri süren köşe taşı yöntemlerinden biri için sahadaki insanlar tarafından sessiz bir hayranlık.
FCS, 1990’larda konfokal mikroskopların mevcudiyeti ile parlamaya başladı ve o zamandan beri kimyasal reaksiyonları, agregaların oluşumunu, hücrelerde moleküler hareketleri ve moleküllerin membranlara bağlanması için aktif olarak kullanıldı.
Tüm bu süreçleri moleküler ölçekte inceleyerek, fizyoloji ve malzeme biliminin birçok yönünü tek molekül düzeyinde incelemek mümkün olur. Araştırmacılar bu süreçleri derinlemesine anlayarak ilaçlar tasarlayabilir, yeni hücre içi etkileşimleri keşfedebilir ve materyalleri aksi takdirde imkansız veya çok zor olacak şekilde ilerletebilirler.
Estonyalı bilim adamlarından yeni atılım
Son zamanlarda, Sistem Biyolojisi Laboratuvarı’ndan (Sibernetik Bölümü, Taltech) Estonyalı bilim adamlarından oluşan bir ekip, FCS ölçümlerini nasıl analiz ettiğimizi ve bu yaklaşımdaki en büyük zayıflıklardan birini nasıl ele aldığımızı devrim yaratabilecek bir çalışma yayınladı. Başlangıçta yapay zeka için inşa edilmiş güçlü hesaplama araçları kullandılar, ancak AI’nın “kara kutu” yöntemlerine güvenmek yerine, şeffaf, fizik tabanlı modelleri optimize etmek için bu araçları uyguladılar. Çalışmaları dergide yayınlandı Bilim ilerlemeleri.
Neyin başarıldığını ve neden önemli olduğunu açıklamak için önce FC’lerin temellerini kapsamamız gerekiyor. Özünde FCS, çok küçük bir hacimden veri kaydederek çalışır – bir femtolitre (bir litre katrilyonda bir litre, Olimpik yüzme havuzundaki en küçük bir kum tanesi).
Klasik haliyle FCS, bu kadar küçük bir ölçüm hacmini mümkün kılmak için bir konfokal mikroskop kullanır. Bir konfokal mikroskopta, bir hücre veya başka bir nesne olsun, bir lazer numuneye odaklanır ve sinyal sadece lazerin odağındaki çok küçük hacimden toplanır. FCS, bu ciltte floresan olabilen çok az molekülümüz olduğunda uygulanır – belirli moleküllerin fotonlar tarafından heyecanlandığında ışığı yaymasına izin veren bir özellik.
Çok az molekülle, sinyal çok gürültülü hale gelir. Bununla birlikte, sinyaldeki artışları hacme gelen, kimyasal reaksiyonlar yoluyla değişen veya yüzeylere yapışan moleküllerle ilişkilendirmek mümkündür. Prensip olarak, bu hacimdeki floresanı değiştiren her şey, hareket veya reaksiyon gibi bazı fiziksel süreçlerle ilişkili olabilir.
FCS nasıl çalışır?
FCS sinyal işleme hakkında sezgi oluşturmak için, bir dükkandaki bir kasiyerin diğerinden daha hızlı çalışıp çalışmadığını öğrenmek istediğinizi hayal edin. Bir seçenek, sadece birinin çalışmasına izin vermek ve uzun bir müşteri kuyruğunu ne kadar hızlı işleyebileceklerini görmektir. Ne yazık ki, basit olsa da, bu deney oldukça büyük bir grup mutsuz müşteri ile sonuçlanacaktır. Alternatif, her iki kasiyerin de az sayıda müşteri olduğu sessiz dönemlerde çalışmasını sağlamak ve her müşteri ödeme noktasına ve yapraklara vardığında kaydolmaktır.
Her kasiyerin etrafındaki küçük alana odaklanarak, bir müşterinin işlenmesi için ortalama süreyi ve bu kasiyerlerin farklı hızlarda çalışıp çalışmadığını belirleyebilirsiniz. Bu aslında FCS’nin moleküllerle yaptığı şeydir: floresan sinyalleri arttığında (gözlem hacmine giren moleküller) ve azaldığında (ayrılan moleküller), FC’ler ne kadar hızlı hareket ettikleri gibi karşılık gelen moleküler özellikleri türetebilir.
Otokorelasyon ve istatistiksel sorunu
Müşterileri oldukça kolay izleyebilirken, moleküler düzeyde çalışmak kötü sinyal kalitesi nedeniyle acil sorunlar yaratır. Moleküller her zaman foton yaymaz, birçok foton kaçırılır ve istenmeyen sinyaller müdahale edebilir – verileri çok gürültülü hale getirir. Bunun üzerinde çalışmak için FCS, analiz etmek için çok sayıda veri toplayarak hızlı bir şekilde (her mikrosaniye) ve tekrar tekrar ölçer. Böyle gürültülü bir sinyalden analiz edilebilen bir şeyi çıkarmanın çok yararlı bir yolunun sinyalin otokorelasyonunu hesaplamak olduğu ortaya çıkıyor.
Esasen, otokorelasyon size floresanda bir artış gözlemlediğinizde bir süre sonra yüksek bir sinyal görme şansını anlatır. Gerçekten de, büyük, yavaş hareket eden bir molekül gözlem hacmine girerse, sinyal o molekül dolaşana kadar yükselir. Bu otokorelasyonları analiz ederek, moleküllerin ne kadar hızlı hareket ettiğini belirleyebiliriz.
Yıllar boyunca, FCS gelişimi bize bir parmak izi gibi otokorelasyonların nasıl okunacağını öğretti – basit moleküler hareket, kimyasal reaksiyonlar, farklı boyutlardaki parçacıklar veya birbirleriyle etkileşime giren parçacıklar görüp görmediğimizi ortaya koyuyor. Ancak, bu otokorelasyonları nasıl analiz ettiğimizle ilgili büyük bir sorun var. Sorun istatistikseldir: Tüm otokorelasyon değerleri aynı tek deneyden geldiğinden, gerçekten bağımsız ölçümler değildir.
Bunu anlamak için, her dakika bir günlük sıcaklık ölçümleri aldığını ve sorduğunu düşünün: “Şimdi sıcaklık 1 saat önce ne kadar benzer? 2 saat önce? 4 saat önce?” Her karşılaştırma size sıcaklık modelleri hakkında gerçek bir şey söyler – desen, güneşli bir gün veya bulutlu olup olmadığını bile ortaya çıkarır. Ancak tüm bu benzerlik ölçümleri aynı sıcaklık veri kümesinden geldiğinden, istatistiksel olarak bağımsız değildir.
Sonuç olarak, sonuçlarınızın güvenilirliğini düzgün bir şekilde değerlendiremezsiniz – bir hava durumu modeli için güçlü kanıtlarınız olduğunu düşünebilirsiniz, ancak gerçekten bir günlük verilerin birden fazla şekilde analiz edildiğini düşünebilirsiniz. Benzer şekilde, FCS’de, farklı zaman gecikmelerindeki her otokorelasyon değeri moleküler davranış hakkında gerçek bilgileri ortaya çıkarırken, hepsi aynı floresan verilerinin üst üste binen kısımlarından hesaplanır.
Rahatsız seçimler
Bu otokorelasyonları birkaç araştırma grubu tarafından gösterildiği gibi doğru bir şekilde analiz etmek için, deneylerin pratik ve hatta mümkün olandan çok daha uzun olması gerekir. Deney süresi nihayetinde, hücrenizin veya diğer nesnenin işleyebileceği lazer maruziyeti miktarı ile sınırlıdır ve canlı hücreler için bu sefer oldukça sınırlıdır. Bu rahatsız edici bir seçim yaratır: FCS’yi yanlış kullanın veya sistemi hiç incelemeyin.
Yaklaşık altı yıl önce, ABD’deki bir araştırma grubu alternatif bir yaklaşım önerdi: analizden otokorelasyonu bırakmak ve FCS ile aynı bilgileri çıkarmak için doğrudan gürültülü deneysel verilerle doğrudan çalışan matematiksel modelleri kullanmak. Amaçları, daha az veri gerektirerek deney süresini kısaltmaktı. Diğerleri gibi, Estonya ekibi de bu yaklaşıma çok ilgi duyuyordu ve bunu kalp kas hücrelerinde moleküler hareketi incelemek için uygulamak istedi.
Bununla birlikte, orijinal uygulamanın çok yavaş olduğu ve beklenmedik bir şekilde, bir araştırmacının molekülün ne kadar parlak olduğu konusundaki tahmini gibi temel özellikler hakkında ilk tahminlere oldukça duyarlı olduğu ortaya çıktı. Bu hassasiyet, yanlış cevaplara ulaşmaya veya herhangi bir cevap bulamamaya neden olabilir. Bu nedenle, gürültülü FCS verilerini doğrudan analiz etme fikri çok cazip olsa da – özellikle geleneksel FC’leri rahatsız eden istatistiksel veri işleme sorunlarından da kaçınacağı için – onu uygulamakla ilgili birçok pratik sorun vardı.
Fitsa, FCS’den birkaç kez daha az veri gerektirdi
Son çalışmalarında, Estonya grubu daha önce önerilenle aynı fikre dayanan yeni bir yöntem yayınladı – doğrudan floresan sinyalini analiz etti – ancak daha önceki uygulamada karşılaşılan birçok sorunun üstesinden geldi. Yeni yöntemin – floresan yoğunluk izi istatistiksel analizinin (fitsa) – çok sağlam olduğunu ve deneyden önce moleküler özellikler hakkında kesin bilgi gerektirmediğini gösterdiler.
Özellikle ilginç olanı, klasik FC’lere karşı fitsa kullanarak moleküler özellikleri tahmin etmek için ne kadar daha az veriye ihtiyaç duyulduğunun kantitatif analizidir. FCS’yi yanlış modunda kullanırken bile, Fitsa FCS’den birkaç kez daha az veri gerektiriyordu. FCS ile düzgün bir şekilde uygulanması gerektiği gibi karşılaştırılırken, farklılıklar şaşırtıcı hale gelir: Fitsa, FCS’den 300 ila 21.000 kat daha az veri gerektirir. Bu kadar büyük farklılıklar nedeniyle Fitsa, bu süreçleri daha önce mümkün olmayan bilimsel titizlikle incelemek için yeni fırsatlar açıyor.
Araştırmacılar, Fitsa ve benzer yaklaşımlara dayanan yöntemlerin, Klasik FCS analiz boru hatlarının yaşam ve malzeme bilimindeki tüm uygulamalarında yerini alacağını öngörmektedir. Şu anda, çözmek için hala birçok pratik sorun var, ancak Fitsa’nın gösterdiği şey, deneysel verilerin doğrudan analizinde büyük bir avantaj olması. Daha fazla ilerlemeyle, moleküler ortamları ve moleküler etkileşimleri çok daha hassas bir şekilde incelememize izin verecektir.
Çıkarımlar dönüştürücü olabilir: ilaçların benzeri görülmemiş bir hassasiyetle hastalıklı hücrelerle nasıl etkileşime girdiğini takip edebildiğinizi veya canlı hücrelerdeki moleküler davranışlarını gözlemleyerek binlerce potansiyel yeni ilacı hızla taradığınızı hayal edin. FITSA, araştırmacıların, kalp hastalıklarından gelişmiş malzemelerin gelişimine kadar her şeyi anlayışımızda devrim yaratarak, potansiyel olarak uzun deneyler gerektiren hücresel süreçleri incelemelerini sağlayabilir.
