Optik mikroskopi, hücrelerdeki dinamik biyolojik süreçleri anlamak için önemli bir tekniktir, ancak bu yüksek hızlı hücresel dinamiklerin yüksek uzamsal çözünürlükte doğru bir şekilde gözlemlenmesi uzun zamandır zorlu bir görev olmuştur.
Şimdi, yayınlanan bir makalede Işık: Bilim ve UygulamalarOsaka Üniversitesi’nden araştırmacılar, işbirliği kurumlarıyla birlikte, dinamik hücresel aktivitede tam olarak seçilmiş bir zaman noktasında yüksek çözünürlüklü, nicel olarak doğru bir anlık görüntü alan kriyo-optik bir mikroskopi tekniğini tanıttılar.
Hızlı dinamik hücresel olayları, zamansal çözünürlük ve “foton bütçesi” arasındaki temel değiş tokuş nedeniyle, yani görüntü için ne kadar ışık toplanabileceği için büyük bir zorluk olmuştur. Sınırlı fotonlar ve sadece loş, gürültülü görüntüler, hem boşlukta hem de zamandaki önemli özellikler gürültüde kaybolur.
Baş yazarlardan biri olan Kosuke Tsuji, “Görüntülemedeki hızı kovalamak yerine tüm sahneyi dondurmaya karar verdik.” “Canlı hücre ve kriyo-sabitleme mikroskopisinin avantajlarını birleştirmek için özel bir numune dondurma odası geliştirdik. Optik mikroskop altında canlı hücreleri hızla dondurarak, yüksek çözünürlüklerde hücresel dinamiklerin dondurulmuş bir görüntüsünü gözlemleyebiliriz.”
Örneğin, ekip canlı kalp kas hücrelerinde kalsiyum iyon dalgası yayılmasını dondurdu. Karmaşık olarak ayrıntılı dondurulmuş dalga daha sonra, yavaş görüntüleme alma hızı nedeniyle normalde hızlı hücresel dinamikleri gözlemleyemeyen süper çözünürlüklü bir tekniği kullanılarak üç boyutta gözlenmiştir.
Kıdemli yazar Katsumasa Fujita, “Bu araştırma perspektifte cesur bir değişimle başladı: optik görüntüleme sırasında dinamik hücresel süreçleri tutuklamak yerine onları harekete geçirmek için mücadele etmek yerine. Bunun güçlü bir temel teknik olarak hizmet edeceğine inanıyoruz,” diyor kıdemli yazar Katsumasa Fujita.
Baş yazarlardan biri olan Masahito Yamanaka, “Tekniğimiz, canlı hücrelerin hem uzamsal hem de zamansal özelliklerini anlık dondurarak korur, hücrelerini ayrıntılı olarak gözlemlemeyi mümkün kılar.
Araştırmacılar ayrıca bu tekniğin nicelik doğruluğunu nasıl geliştirdiğini gösterdiler. Bir floresan kalsiyum-iyon probu ile etiketlenmiş hücrelerle, canlı hücre görüntülemede pratikten 1000 kat daha uzun pozlama sürelerini kullanabildiler ve ölçüm doğruluğunu önemli ölçüde artırdılar.
Kesin olarak tanımlanmış anlarda geçici biyolojik olayları yakalamak için, araştırmacılar elektriksel olarak tetiklenen bir kriyojen enjeksiyon sistemini entegre ettiler. Kalsiyum iyon dalgalarını indüklemek için UV ışık stimülasyonu ile bu sistem, olayın başlamasından sonra belirli bir zaman noktasında kalsiyum iyon dalgalarının 10 ms hassasiyetle donmasını sağladı. Bu, ekibin benzeri görülmemiş zamansal doğrulukla geçici biyolojik süreçleri tutuklamasına izin verdi.
Son olarak, ekip dikkatlerini zamanında hizalanması zor olan farklı görüntüleme tekniklerini birleştirmeye ayarladı. Numunelerin yakınında donması ile, geçici uyumsuzluk konusunda endişelenmeden çoklu görüntüleme yöntemleri artık sırayla uygulanabilir. Çalışmalarında ekip spontan Raman mikroskopisi ve süper çözünürlüklü floresan mikroskopisini aynı kriyofiksed hücreler üzerinde birleştirdi. Bu, karmaşık hücresel bilgileri aynı zamanda aynı noktada bir dizi perspektiften görmelerini sağladı.
Bu yenilik, hızlı, geçici hücresel olayları gözlemlemek için yeni yollar açarak araştırmacılara dinamik biyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç sağlıyor.
