Floresan testi, bitki bileşiklerini değiştiren binlerce enzim çeşidinin taranmasını hızlandırır

Birçok doğal bitki bileşiği umut verici sağlıkla ilgili özelliklere sahiptir, ancak suda çözünürlüklerinin zayıf olması, bunların ne kadar etkili bir şekilde emilip kullanıldığını sınırlayabilir. Önceki çalışmalarda araştırmacılar, Bacillus subtilis’ten fenolik fosfat sentetaz (BsPPS) adı verilen ve fosfat gruplarını çok çeşitli fenolik bileşiklere bağlayabilen bir enzim keşfettiler. Bu modifikasyon, bu bileşiklerin suda daha fazla çözünebilir hale getirilmesine yardımcı olabilir ve gelişmiş nutrasötiklerin ve ilgili ürünlerin geliştirilmesini destekleyebilir.

BsPPS’yi daha kullanışlı hale getirmek ve diğer ilgili fenolik bileşik-fosforilasyon enzimlerini araştırmak için, enzim aktivitesini ölçmek için hızlı ve uygun bir yönteme ihtiyaç vardır. Bu özellikle önemlidir çünkü BsPPS, çeşitli fenolik bileşikleri fosforile edebilen yeni tanımlanmış bir enzim grubunu temsil eder.

HPLC gibi geleneksel analitik yöntemler, ürünleri doğru bir şekilde ölçebilir ancak binlerce örneğin taranması için çok yavaştır ve emek yoğundur.

Floresan kaybı enzim aktivitesinin sinyalini verir

Yayınlanan bu çalışmada Gıda KimyasıAraştırmacılar, BsPPS aktivitesinin bir göstergesi olarak küçük bir floresan bileşiği olan umbelliferonu (UMB) kullanarak floresans bazlı bir tarama yöntemi geliştirdiler. UMB normalde güçlü bir floresan sinyali üretir.

BsPPS, UMB’ye bir fosfat grubu ekleyerek umbelliferon 7-fosfat (U7P) ürettiğinde floresansı belirgin şekilde azalır. Bilim adamları bu azalmayı standart bir mikroplaka okuyucuyla ölçerek enzimin ne kadar aktif olduğunu hızlı bir şekilde tahmin edebilirler.

Isıya dayanıklı enzim varyantlarının taranması

Araştırmacılar ölçüm koşullarını sistematik olarak optimize etti ve yöntemin doğru, tekrarlanabilir ve birçok numuneyi paralel olarak test etmeye uygun olduğunu doğruladı. Ayrıca tahlili, bir enzimin çok az farklı versiyonlarının üretildiği ve yararlı özellikler açısından tarandığı bir teknik olan yönlendirilmiş evrim ile de birleştirdiler.

Bu yaklaşımı kullanarak binlerce BsPPS varyantı tarandı ve benzer katalitik performansı korurken ısıl işlemden sonra orijinal enzime göre daha fazla aktiviteyi koruyan G145D adı verilen bir varyant tanımlandı.

Genel olarak, bu floresans bazlı tahlil, BsPPS’nin hızlı taranması ve mühendisliği için pratik bir platform sağlar. Aynı zamanda ilgili fenolik bileşik-fosforilasyon enzimlerinin gelecekte araştırılmasını desteklemekte ve bitki kaynaklı biyoaktif bileşiklerin suda çözünür fosforile edilmiş türevlerinin üretilmesi için geliştirilmiş biyokatalizörlerin geliştirilmesini kolaylaştırmaktadır.

Ulusal Tayvan Üniversitesi’nde tarım kimyası profesörü olan ilgili yazar Nan-Wei Su, “Enzim aktivitesini kolayca ölçülebilir bir floresans sinyaline dönüştürerek, binlerce enzim varyantını çok daha verimli bir şekilde inceleyebilir, gelişmiş biyokatalizörlerin gelişimini hızlandırabilir ve fenolik bileşik fosforile edici enzimlerin araştırılmasını kolaylaştırabiliriz” diyor.