Tasarlanmış lipaz, daha yüksek değerli özel lipitlerin üretimini artırabilir

Gıda ve ilaç üreticileri, dikkatle kontrol edilen yağ asidi bileşimlerine sahip lipitleri giderek daha fazla aramaktadır. Bununla birlikte, doğal yağlar genellikle yakından ilişkili yağ asitlerinin karışımlarını içerir ve geleneksel enzimler çoğu zaman bunları güvenilir bir şekilde ayırt edemez.

Uluslararası bir araştırma ekibi, aralarında yalnızca iki karbon atomu farkı olmasına rağmen, palmitik C16 asil zincirlerini oleik C18 asil zincirlerine göre tercihen hidrolize eden bir lipaz tasarladı. Çalışmaları dergide yayınlandı Biyokaynak Teknolojisi.

Çalışma, hesaplamalı protein tasarımını, laboratuvar testlerini, moleküler dinamik simülasyonları ve iki fazlı mikroakışkan deneylerini birleştiriyor. Yaklaşım, beslenme, gıda işleme ve farmasötik uygulamalar için doğal yağların daha hassas modifikasyonunu destekleyebilir.

Daha seçici bir lipit işleyen enzim

Lipazlar katı ve sıvı yağları parçalamak, yeniden düzenlemek veya sentezlemek için yaygın olarak kullanılır. Endüstriyel değerleri kısmen belirli yağ asitleri üzerinde ne kadar seçici davrandıklarına bağlıdır.

Çoğu geleneksel lipaz, kısa, orta ve uzun zincirli yağ asitleri arasında yalnızca genel bir ayrım yapar. Uzun zincirli bir yağ asidini seçici olarak hedef alırken yakından ilişkili olanı büyük ölçüde dokunulmadan bırakmak hala zor.

Araştırmacılar Ustilago trichophora’dan elde edilen bir lipazla başladılar. Yağ asidi zincirlerinin enzimin substrat bağlama tüneline nasıl uyduğunu kontrol edebilecek amino asit pozisyonlarını tanımlamak için hesaplamalı modelleme kullanıldı.

Daha sonra binlerce olası varyantı taramak yerine küçük, hedefe yönelik bir mutant kütüphanesi oluşturuldu ve test edildi. I291Y adı verilen bir varyant en güçlü aday olarak ortaya çıktı. Bu enzimde 291. pozisyondaki izolösin, tirozin ile değiştirilmiştir.

C16 zincirleri için güçlü tercih

Palmitik asit substratları için kullanılan test koşulları altında I291Y varyantı, karşılık gelen oleik C18:1 substratına karşı aktivitesinin 41,65 katı olan, C16:0’ı temsil eden p-nitrofenil palmitata karşı hidrolitik aktivite gösterdi.

Orijinal enzimle karşılaştırıldığında, tasarlanmış varyantlar C16:0’a yönelik seçici katalitik aktiviteyi 0,79 ila 28,48 kat artırdı.

Kinetik analiz aynı zamanda C16 substratı için I291Y’nin maksimum reaksiyon oranının C18 substratından %284,19 daha yüksek olduğunu gösterdi. C16’ya yönelik katalitik verimliliği, orijinal enzimle karşılaştırıldığında yaklaşık %115 arttı.

Mutasyon aynı zamanda termal stabiliteyi de geliştirdi. 70°C’de (158°F), C16 substratına etki ettiğinde I291Y’nin yarı ömrü, orijinal enzim için yaklaşık 24 dakikadan yaklaşık 123 dakikaya çıktı.

Bu geliştirilmiş stabilite, yüksek sıcaklıklarda çalışan endüstriyel işlemler için önemli olabilir.

Enzimin iç tünelinin yeniden şekillendirilmesi

Araştırmacılar, mutasyonun seçiciliği neden değiştirdiğini araştırmak için moleküler yerleştirme ve moleküler dinamik simülasyonlarını kullandılar.

Analizleri, izolösinin daha büyük tirozin kalıntısıyla değiştirilmesinin, enzimin dahili substrat bağlanma tünelini yeniden şekillendirdiğini ileri sürüyor. Tünel kısaldı ve daha az kavisli hale geldi; bu da düz, doymuş C16 zincirinin daha kolay yerleşmesini sağlarken, daha uzun ve bükülmüş C18:1 zinciri için daha büyük sterik engel oluşturdu.

Simülasyonlar ayrıca, katalitik bölgeye erişimi kontrol eden enzimin başlık ve kanat bölgelerinin hareketindeki değişiklikleri de gösterdi.

Bu mekanizma yapısal bir hipotez olmaya devam ediyor ve kristalografik doğrulama gerektiriyor. Ancak bu, katalitik davranışta ölçülen değişimle tutarlıdır.

Enzimin yağ-su arayüzü altında test edilmesi

Lipazlar normalde yağ ve suyun buluştuğu yerde etki gösterir. Araştırmacılar bu nedenle basitleştirilmiş laboratuvar substratlarının ötesine geçti ve enzimi iki fazlı bir mikroakışkan sistemde test etti.

Akış odaklı bir mikroçip, küçük damlacıklar ve kontrollü bir yağ-su arayüzü oluşturdu. Tasarlanan enzim, C16 asil zincirleri içeren gliseril tripalmitata ve C18:1 zincirleri içeren gliserol trioleata karşı test edildi.

I291Y enzimi, orijinal enzime göre önemli ölçüde daha fazla palmitik asil zincirini gliseril tripalmitattan hidrolize ederken, gliserol trioleattaki oleik zincirlere karşı ihmal edilebilir aktivite gösterdi.

Araştırmacılar ayrıca doğal olarak hem palmitik hem de oleik asit içeren ipekböceği pupa yağını da test etti. Tasarlanan enzim, yağın sn-2 konumundaki göreceli palmitik asit miktarını önemli ölçüde azalttı.

Endüstri alaka düzeyi

Yakından ilişkili yağ asidi zincirlerini ayırt etme yeteneği, üreticilerin lipit kompozisyonunu daha doğru bir şekilde uyarlamasına yardımcı olabilir.

Potansiyel uygulamalar şunları içerir:

• yenilebilir yağların büyük miktarlarda harici yağ asidi donörleri eklemeden değiştirilmesi;
• seçilmiş besinsel özelliklere sahip yapılandırılmış ve fonksiyonel lipitlerin üretilmesi;
• doymuş yağ asitlerinin seçici olarak uzaklaştırılması veya yeniden dağıtılması;
• özel gıdalar ve beslenme ürünleri için lipit içerikleri yaratmak;
• böcek yağlarının ve diğer az kullanılan doğal lipit kaynaklarının değerinin arttırılması; Ve
• farmasötik lipitler için enzim bazlı işleme yollarının geliştirilmesi.

Çalışma aynı zamanda etkili bir enzim geliştirme stratejisini de ortaya koyuyor. Hesaplamalı tarama, aramayı az sayıda umut verici mutasyona daraltarak çok büyük deneysel kütüphanelere olan ihtiyacı azalttı.

Endüstriyel biyoteknoloji şirketleri için sanal tasarım ve odaklanmış laboratuvar doğrulamasının bu kombinasyonu, enzim geliştirme döngülerini kısaltabilir ve tarama maliyetlerini düşürebilir.

Daha fazla gelişme gerekli

Araştırma laboratuvar ve mikroakışkan ölçeklerde gerçekleştirildi. Enzimin gerçek yağ karışımları, daha büyük reaktörler ve sürekli işleme için optimize edilmesi amacıyla ek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Endüstriyel çalışmaların ayrıca enzim üretim maliyetlerini, immobilizasyon ve yeniden kullanımı, uzun vadeli stabiliteyi, ürün ayırmayı, gıda sınıfı gerekliliklerini ve daha geniş bir doğal yağ yelpazesindeki performansı değerlendirmesi gerekecektir.

Enzim ayrıca bir değiş tokuş gösterdi: C16’ya yönelik tercihi ve katalitik etkinliği artarken, bazı koşullar altında maksimum reaksiyon hızı orijinal enziminkinden daha düşük kaldı.

Bununla birlikte çalışma, araştırmacıların “lipit düzenlemesi” olarak tanımladığı, karmaşık lipitler içindeki seçilmiş yağ asidi zincirlerinin kontrollü modifikasyonu için bir temel sağlıyor.